2×实时荧光定量PCR扩增预混合溶液( 抗体法,No Rox)
产品名称: 2×实时荧光定量PCR扩增预混合溶液( 抗体法,No Rox)
英文名称: UNICONTM qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,No Rox)
产品编号: 11198ES03
产品价格: 336.00
产品产地: 翌圣生物
品牌商标: Yeasen
更新时间: 2024-12-10T11:18:52
使用范围: null
规格 | 价格 |
1 mL | 336.0 |
5×1 ml | 1466.0 |
50×1mL | 11086.0 |
100×1mL | 17596.0 |
- 联系人 : 李自转
- 地址 : 上海市浦东新区天雄路166弄一号楼三层南单元
- 邮编 : 200030
- 所在区域 : 上海
- 电话 : 139****5640 点击查看
- 传真 : 点击查看
- 邮箱 : lizizhuan@yeasen.com
- 二维码 : 点击查看
产品简介
本产品是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。采用的抗体法热启动DNA聚合酶(Cat#10113),在预变性温度(95℃)加热30 sec,UNICON® Taq抗体失活,释放出Taq DNA Polymerase活性。抗体法热启动Taq酶可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。同时,配方优化了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子,适合低浓度模板的扩增,使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的标准曲线。
Mix中含有Hieff® Taq DNA Polymerase、UNICON® Taq抗体、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用时,仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR,大大简化操作过程,降低污染几率。
产品信息
货号 |
11198ES03 / 11198ES08 / 11198ES25 / 11198ES50 / 11198ES60 |
规格 |
1 mL / 5×1 mL / 5×5 mL / 10×5 mL / 20×5 mL |
储存条件
-25~-15℃避光保存,有效期18个月。本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR Green I,保存或配制反应体系时需避免强光照射。
使用说明
- 反应体系(推荐冰上配制)
组分 |
体积 (μL)**** |
体积 (μL) |
终浓度 |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法,No Rox)* |
25 |
10 |
1× |
Forward Primer (10 μM)** |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM)** |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
模板DNA*** |
X |
X |
- |
RNase Free H2O |
to 50 |
to 20 |
- |
*使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。
**通常引物终浓度为0.2 μM,也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。
***如模板类型为未稀释cDNA原液,使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。cDNA原液建议5-10倍稀释,最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。
****推荐使用20 μL或50 μL总体积,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
2.扩增程序*
1)两步法
循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
预变性** |
95℃ |
30 sec |
1 |
变性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
退火/延伸*** |
60℃ |
30 sec**** |
|
熔解曲线阶段***** |
仪器默认设置 |
1 |
2)三步法
循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
预变性** |
95℃ |
30 sec |
1 |
变性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
退火*** |
55-60℃ |
20 sec |
|
延伸 |
72℃ |
20 sec**** |
|
熔解曲线阶段***** |
仪器默认设置 |
1 |
*高特异性可选择两步法,高效率扩增可选择三步法。
**预变性时间可根据不同模板和引物的具体情况适当增加至3-5 min。
***退火温度和时间请根据引物和目的基因的长度进行调整。
****荧光信号采集请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置,几种常见仪器的时间设定如下:
30sec以上:Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast;Roche Applied Science: LightCycler 480;Bio-Rad: CFX96
31sec以上:Applied Biosystems: 7300
34sec以上:Applied Biosystems: 7500
*****熔解曲线通常情况下可以使用仪器默认程序。
- 结果分析
定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。
1)扩增曲线
- Ct值落在20-30之间时,定量分析最准确;
- Ct值小于10,需要将稀释模板后,重新进行实验;
- Ct值介于30-35之间时,需要提高模板浓度,或增大反应体系的体积,以提高扩增效率,保证结果分析的准确性;
- Ct值大于35时,检测结果无法定量分析基因的表达量,但可用于定性分析。
2)熔解曲线
a. 熔解曲线单峰,表明反应特异性好可以进行定量结果分析;若熔解曲线出现双峰或者多峰,则不能进行定量分析。
b. 熔解曲线出现双峰,需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。
c. 如果是引物二聚体,建议降低引物浓度,或者重新设计扩增效率高的引物。
d. 如果是非特异性扩增,请提高退火温度,或者重新设计更高特异性的引物。
- 引物设计指南
1) 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳,可以在100 bp-300 bp内选择。
2) 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。
3) 引物碱基分布要均匀,避免出现连续的4个相同碱基,GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。
4) 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
5) 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。
6) 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测,只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。
5. 适用机型
Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;
Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;
Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.
注意事项
1. 解冻后Master Mix可能出现絮状物质,4℃放置并上下颠倒混匀至溶液澄清,不影响试剂性能。
2. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒(Cat#11141),以有效去除RNA样品中残留的基因组。
3. 本产品仅作科研用途。
4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
Ver.CN20240108