2×实时荧光定量PCR扩增预混合溶液( 抗体法,No Rox)-PCR/RT-PCR/qPCR-试剂-生物在线
翌圣生物科技(上海)股份有限公司
2×实时荧光定量PCR扩增预混合溶液( 抗体法,No Rox)

2×实时荧光定量PCR扩增预混合溶液( 抗体法,No Rox)

商家询价

产品名称: 2×实时荧光定量PCR扩增预混合溶液( 抗体法,No Rox)

英文名称: UNICONTM qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,No Rox)

产品编号: 11198ES03

产品价格: 336.00

产品产地: 翌圣生物

品牌商标: Yeasen

更新时间: 2024-12-10T11:18:52

使用范围: null

规格 价格
1 mL 336.0
5×1 ml 1466.0
50×1mL 11086.0
100×1mL 17596.0
翌圣生物科技(上海)股份有限公司
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产品简介

 

本产品是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。采用的抗体法热启动DNA聚合酶(Cat#10113),在预变性温度(95℃)加热30 sec,UNICON® Taq抗体失活,释放出Taq DNA Polymerase活性。抗体法热启动Taq酶可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。同时,配方优化了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子,适合低浓度模板的扩增,使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的标准曲线。

Mix中含有Hieff® Taq DNA Polymerase、UNICON® Taq抗体、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用时,仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR,大大简化操作过程,降低污染几率。

 

产品信息

 

货号

11198ES03 / 11198ES08 / 11198ES25 / 11198ES50 / 11198ES60

规格

1 mL / 5×1 mL / 5×5 mL / 10×5 mL / 20×5 mL

 

储存条件

 

-25~-15℃避光保存,有效期18个月。本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR Green I,保存或配制反应体系时需避免强光照射。

 

使用说明

 

  1. 反应体系(推荐冰上配制)

组分

体积 (μL)****

体积 (μL)

终浓度

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法,No Rox)*

25

10

Forward Primer (10 μM)**

1

0.4

0.2 μM

Reverse Primer (10 μM)**

1

0.4

0.2 μM

模板DNA***

X

X

-

RNase Free H2O

to 50

to 20

-

*使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。

**通常引物终浓度为0.2 μM,也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

***如模板类型为未稀释cDNA原液,使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。cDNA原液建议5-10倍稀释,最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。

****推荐使用20 μL或50 μL总体积,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

2.扩增程序* 

 1)两步法

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性**

95℃

30 sec

1

变性

95℃

10 sec

40

退火/延伸***

60℃

30 sec****

熔解曲线阶段*****

仪器默认设置

1

2)三步法

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性**

95℃

30 sec

1

变性

95℃

10 sec

40

退火***

55-60℃

20 sec

延伸

72℃

20 sec****

熔解曲线阶段*****

仪器默认设置

1

*高特异性可选择两步法,高效率扩增可选择三步法。

**预变性时间可根据不同模板和引物的具体情况适当增加至3-5 min。

***退火温度和时间请根据引物和目的基因的长度进行调整。

****荧光信号采集请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置,几种常见仪器的时间设定如下:

30sec以上:Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast;Roche Applied Science: LightCycler 480;Bio-Rad: CFX96

31sec以上:Applied Biosystems: 7300

34sec以上:Applied Biosystems: 7500

*****熔解曲线通常情况下可以使用仪器默认程序。

  1. 结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1)扩增曲线

  1. Ct值落在20-30之间时,定量分析最准确;
  2. Ct值小于10,需要将稀释模板后,重新进行实验;
  3. Ct值介于30-35之间时,需要提高模板浓度,或增大反应体系的体积,以提高扩增效率,保证结果分析的准确性;
  4. Ct值大于35时,检测结果无法定量分析基因的表达量,但可用于定性分析。

2)熔解曲线

a.   熔解曲线单峰,表明反应特异性好可以进行定量结果分析;若熔解曲线出现双峰或者多峰,则不能进行定量分析。

b.   熔解曲线出现双峰,需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

c.   如果是引物二聚体,建议降低引物浓度,或者重新设计扩增效率高的引物。

d.   如果是非特异性扩增,请提高退火温度,或者重新设计更高特异性的引物。

  1. 引物设计指南

1) 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳,可以在100 bp-300 bp内选择。

2) 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。

3)  引物碱基分布要均匀,避免出现连续的4个相同碱基,GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4)  引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5)  引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6)  设计完成的引物需要进行扩增效率的检测,只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

5. 适用机型

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.

 

注意事项

 

1. 解冻后Master Mix可能出现絮状物质,4℃放置并上下颠倒混匀至溶液澄清,不影响试剂性能。

2. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒(Cat#11141),以有效去除RNA样品中残留的基因组。

3. 本产品仅作科研用途。

4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

 

Ver.CN20240108