Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit
产品名称: Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit
英文名称: Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit
产品编号: 11173ES40
产品价格: 2075.00
产品产地: Yeasen
品牌商标: Yeasen
更新时间: 2024-12-10T11:18:52
使用范围: null
规格 | 价格 |
40 rxns | 2075.0 |
100 rxns | 4345.0 |
- 联系人 : 李自转
- 地址 : 上海市浦东新区天雄路166弄一号楼三层南单元
- 邮编 : 200030
- 所在区域 : 上海
- 电话 : 139****5640 点击查看
- 传真 : 点击查看
- 邮箱 : lizizhuan@yeasen.com
- 二维码 : 点击查看
产品简介
Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行基因定量表达分析(如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等),无需提RNA,可直接进行qPCR表达分析,用时短,操作简单,出错率低,最短只需1.5 h就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。试剂盒中包含反转录以及定量检测试剂,可轻松地进行基因表达分析。
产品信息
货号 |
11173ES40 / 11173ES60 |
规格 |
40 T / 100 T |
组分信息
组分编号 |
组分名称 |
11173ES40 |
11173ES60 |
11173-A |
FCD Lysis Buffer* |
2 mL |
5 mL |
11173-B |
FCD Washing Buffer* |
8 mL |
20 mL |
11173-C |
FCD Stop Solution* |
100 μL |
250 μL |
11173-D |
DNase I* |
80 μL |
200 μL |
11173-E |
4× Hifair® FCD RT Mix* |
200 μL |
500 μL |
11173-F |
2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix* |
2 mL |
5 mL |
11173-G |
RNase Free H2O |
2 mL |
5 mL |
*当使用不够时,可另外购买Lysis set(Cat#16814ES)、RT set(Cat#16815ES)、qPCR set(Cat#16816ES)。
储存条件
11173-A和 11173-B未开封时请置于-25~-15℃保存,融解后置于4℃保存,注意防止污染,其余组分长期保存时请于-25~-15℃保存,有效期1年。
使用说明
一、裂解产物的制备
- 将试剂放置室温下融化,使用前上下颠倒,轻轻混匀,并轻微离心后使用,避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
- 将细胞转移至离心管中*,5000 rpm离心2 min收集细胞**,充分吸除培养基。若细胞在96孔板中培养,可直接吸除培养基。
- 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗细胞,5000 rpm离心2 min,吸尽FCD Washing Buffer。
- 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase I溶液,室温吸打混匀后静置5 min,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右,即可得到裂解产物****,细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。
*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 102 - 1× 105 cells,若细胞数量较多,可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。
**不同细胞的离心条件不同,请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。
***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要,加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。
****细胞裂解产物溶液长期保存时,请置于-25~-15℃。
二、反转录
- 室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀,置于冰上并按下表配置反应体系:
组分 |
体积 (μL) |
终浓度 |
4× Hifair® FCD RT Mix |
5 |
1× |
裂解产物* |
x |
- |
RNase-free H2O |
Up to 20 |
- |
表1 反转录反应体系
*避免吸入细胞碎片,推荐使用量为2 μl,最大不超过反应体系的55%。
- 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,按下表程序进行反转录反应**:
反应温度 |
反应时间 |
37℃ |
5 min |
85℃ |
5 sec |
表2 反转录反应程序
**反转录温度推荐使用37℃,反转录产物可直接进行下游qRT-PCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制,得到合适的Ct值(10-35),可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验,可放置于-25~-15℃保存。
三、荧光定量PCR
- 体系配置
使用下列组份比例配制反应液(配制过程请于冰上进行):
组分 |
体积(μL) |
终浓度 |
2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix |
12.5 |
1× |
Forward Primer (10 μM) |
0.5 |
200 nM |
Reverse Primer (10 μM) |
0.5 |
200 nM |
Probe (10 μM) |
0.25-1 |
100-400 nM |
反转录产物* |
x |
- |
RNase-free H2O |
Up to 25 |
- |
表3 qPCR反应体系
*高浓度模板易导致非特异扩增,可适当将模板稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物探针浓度。
- 荧光定量PCR快速扩增程序(推荐)
本产品推荐使用快速程序扩增,可大大减少反应时间。使用Tm值较低的引物难以扩增时,可额外调整退火温度。
循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
预变性 |
95℃ |
10 sec |
1 |
变性 |
95℃ |
5 sec |
45 |
退火/延伸** |
60℃ |
10 sec |
表4 qPCR反应程序(快速)
**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。
- 荧光定量PCR常规扩增程序
实验仪器不满足快速反应时间时,也可使用常规程序进行扩增。
循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
预变性 |
95℃ |
10 sec |
1 |
变性 |
95℃ |
15 sec |
40-45 |
退火/延伸** |
60℃ |
30 sec |
表5 qPCR反应程序(常规)
注意事项
- 使用前,将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
- 实验时,请尽量使用无污染的耗材,避免污染。
- 本产品避免反复冻融,配制时应避免强光照射。
- 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
- 本产品仅作科研用途!
Ver.CN20231207