Fura-2 QBT试剂盒——新型均相Fura-2钙流检测实验

Fura-2 染料一直以来被认为是在细胞成像、GPCR 介导的细胞内钙流、以及离子通道激活等实验中检测钙动员的重要工具。这种比值法检测染料通过计算结合和未结合两种状态之间的荧光强度比值，有助于纠正由于染料添加或细胞铺板造成的误差。然而，传统的Fura-2 染料必须要进行缓冲液清洗，从而对于每一个实验来说都提高孔间差异性并需要耗费更多时间且增加操作复杂性。

Molecular Devices®推出的Fura-2 QBT™钙流试剂盒是基于**的信号湮灭技术，含有比值法检测的Fura-2 钙离子指示剂，提供均相实验体系并减小细胞基础的差异性, 从而通过在检测前去除细胞清洗步骤间接增加通量。另外Fura-2 QBT.钙流试剂盒是在紫外光谱处激发，最大程度使得研究者可以减少488nm激发的化合物荧光信号的干扰。

特点：

基于信号湮灭技术，获得更大信号窗口

免洗和比值法信号检测使得实验差异性降至最低

免洗步骤节省了时间和实验成本

实验原理

Fura-2 AM 是一种钙离子敏感染料，在340 nm 和380 nm 被激发，发射波长是510 nm。染料结合了钙离子后其吸收波长从380nm 转移到340nm。图1 显示了钙离子结合Fura-2 后340/510nm 发射的信号（绿）的增加，而380/510 nm 发射的信号（橙）下降。计算两种发射的信号比值（插图）来检测用于拟合量效曲线的最大值减去最小值后的信号效应。

Fura-2 QBT.钙流实验准备

本次实验中使用的是小规格的Fura-2 QBT.钙流试剂盒（PN #R8197）。染料重悬在含有20 mM HEPES 的 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）。 丙磺舒（PBX）在需要时加入，用以抑制染料被转移出细胞内。贴别的CHO M1 细胞或HeLa 细胞实验前过夜种在黑壁底透的384 孔板中，在试验时从培养箱中取出。含有Fura-2 QBT 染料或者其它染料的25μL 缓冲液加入到每个孔中，同时孔中需含有25μL 缓冲液或培养基。加载了Fura-2 QBT.钙流试剂（PN #R8197）或BD 比值法钙流试剂（#644243）的细胞记录板在37°C、5%CO2 孵育一小时。为便于对比，采用了传统的Fura-2 清洗方法。

按照此传统的Fura-2 清洗方法，在加入50μL 的1X 染料缓冲液之前去除每个孔中的培养基，然后去其它试剂盒一样细胞记录版在同样的条件和时间下进行孵育。在FlexStation®3 微孔读板机或FLIPR® Tetra 系统上开始记录前，所有记录板从培养箱中取出并降温至室温10 分钟。采用了传统Fura-2 清洗方法的记录板需要在开始记录前用HBSS 实验缓冲液清洗3 次以去除多余的染料。

FlexStation 3 和FLIPR Tetra 系统上的比值法钙流检测实验在384 孔的聚丙烯化合物板中将5 倍浓度的相应配体溶于含20mMHEPES 的HBSS 缓冲液中。在FlexStation3（图2）或FLIPRTetra系统（图3）检测过程中加入激动剂，仪器参数进行了优化以适应于比值法检测实验。染料的激发波长是340nm和380nm。在510 nm 检测到发射信号，每个孔中两个激发波长下的相对荧光单位（RFU）的记录持续大约90 秒，包括加样前和加样后。实验中每个采样时间点的计算后的输出结果是340nm 与380nm 波长信号的比值。最大值减去最小值的计算来源自比值信号曲线。量效曲线和EC50/IC50 浓度统计计算所需的数据从ScreenWorks®或SoftMax® Pro软件中输出， 然后用GraphPad Prism 进一步拟合和计算。 根据Zhang, et. al 发表的方法进行.Z值的计算。

结果

结论

相对于传统Fura-2 实验，Fura-2 QBT.钙流试剂盒提供了均相的实验体系，通过使用Molecular Devices 公司基于信号湮灭的**技术无需再对细胞进行冲洗。因此将提高通量、减小细胞铺板或冲洗时细胞丢失等造成的实验差异性，并节省了实验成本（因为差异性而需要重复实验带来的缓冲液和耗材）。相比于BD 比值法钙流试剂盒（#644243）传统的Fura-2 细胞冲洗实验，Fura-2 QBT.钙流试剂盒可得到最大的信号窗口以及在EC80 或IC80 下最好的Z 值。因为Fura-2 燃料在紫外范围激发，从而避免了化合物488nm 激发的自发荧光的干扰。Fura-2 QBT.钙流试剂盒在FLIPRTetra 系统和FlexStation 3 微孔板检测平台上进行了充分的验证，提供了可重复、可量化操作的解决方案，适合于高通量的筛选工作。