hERG 钾离子通道高通量安全性筛选
——IonWorks Barracuda高通量全自动膜片钳系统多次加样检测方法的优势
特点
• 超高通量——可以满足大批量化合物筛选的需求
» 每小时> 6,000数据点
» 384通道同时记录
• 超低的运行成本
» 稳定、可靠的设备
» 低廉、高效的耗材
• 每孔连续加样方法记录得到的浓度效应数据结果类似于传统手动膜片钳记录结果
• 高一致性、可重复的数据
» **的Population Patch Clamp 技术保证了高度可重复性记录
由于hERG (人 ether-à-go-go基因)被抑制后潜在的致死风险，愈发凸显了在药物研发早期阶段开展候选药物hERG安全性筛选的重要性。因其运行高成本、低通量及对操作人员的高要求，作为研究离子通道活性的和药理学特性金标准的传统膜片钳技术对于大批量的筛选需求来说明显不切实际。即使经过过去十多年全自动膜片钳系统的快速发展，高成本和通量相对较低的因素任然限制了hERG离子通道的安全性筛选。
IonWorks Barracuda® 全自动膜片钳系统为制药和生物技术企业提供了真正的解决方案，低成本、快速、高效地对数以千计的化合物进行hERG离子通道安全性筛选。384道平行记录的性能以及低廉的耗材使得IonWorks Barracuda成为中、高通量大批量化合物筛选的理想设备。
每孔多次加样的方法带来的特点之一是所记录的量效数据类似于传统手动膜片钳记录的数据，这样所产生的数据质量更可靠。这种方法可广泛用于多种离子通道的研究中，特别是观察电压门控离子通道的化合物阻断效应的研究。
研究目的
采用每孔多次加样的方法可以增加通量并节省化合物筛选成本。本研究旨在评估在IonWorks Barracuda系统中进行hERG化合物安全性筛选中使用加样方法的效果，并与Barracuda中另一种整板每孔单点加样的方法进行比较。
IonWorks Barracuda系统支持每个刺激方案下最多８次加样，且一次实验中刺激方案的次数不限，从而在实际上来说每次实验的加样次数是没有限制的。
检测化合物浓度效应的药理学特性时，在整个384孔记录板的每一个记录孔中可以采用从低浓度至高浓度的多次累积加样方法。这种单孔重复多次加样的方法有一下几方面优势：
• 增加通量
• 降低成本
• 与传统检测化合物作用于离子通道效应的方法一致，每个细胞或记录位点加入化合物的多个浓度并检测其连续的梯度浓度效应。
典型的单孔８次加样实验需要大约30分钟，产生>3000数据点，从而每小时可以得到>6000个数据点。
IonWorks Barracuda系统筛选hERG安全性化合物时也可以采用另外一种整板加样且每孔只加样一次的方式。在此方法下，大约每20分钟 完成一次384个数据点的采集，从而每小时可以得到>1100个数据点。
为了有效的比较上述两种加样方法的药理学数据，本次实验使用了完全一致的hERG 阳性抑制剂，并采用６个浓度梯度进行检测。
结果
比较化合物多浓度效应的药理学特性时，单孔多次加样方法比整板单次加样增加了超过４倍的通量。
７个hERG 通道的阳性抑制剂在每个记录孔中连续添加６个梯度浓度。两种加样方法结果（单次加样和多次加样）的比较见表１。通量每次实验增加至2300 个数据点，每小时为4600 个数据点。
材料和方法
稳定转染人Kv11.1 通道的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)来自ChanTest 公司(Cleveland, OH)。本实验中所使用的所有试剂和药品均来自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO).
hERG 离子通道多次加样方法的开发
多次加样的方法中细胞需要进行多次的溶液交换并且电压刺激时间延长，从而增加了电流run down 的可能性。为提高试验时间加长后细胞记录的稳定性，使用单次脉冲电压刺激方案代替原来单次加样方法中的５次脉冲电压刺激方案。
化合物溶于细胞外液中，浓度为3 倍终浓度，含有1% DMSO。实验时加入记录孔后被稀释至最终浓度，DMSO 的浓度为0.33% 。化合物加入记录孔后孵育一分钟后开始给予电压刺激，+40 mV 持续一秒，然后再施加-50 mV 刺激一秒，用以检测尾电流峰值（图1）。一次实验需要准备6 个不同浓度梯度的化合物板，便于加样头完成6 次加样。完整的实验方法确认后，依次检测选定的7 个hERG 阳性药物。
多次加样实验的记录稳定性结果见图2。图中分别展示了其中一次实验所有384 孔的平均封接电阻值，以及24 个对照孔0.33% DMSO 外液6 次加样后得到的尾电流峰值为基准的平均通道激活程度。
单孔多次加样方法的药理学特性：产生的累积浓度效应数据类似于传统膜片钳技术方法
在7 个hERG 阳性药物药理学验证实验中，每次实验需要连续监测6 块化合物板。每个化合物板只有每个待检测化合物的一个浓度，每个化合物重复24 个孔。第一块化合物板的浓度最低，第六块化合物板的浓度最高。
在7 次独立的实验中各自得到一个量效曲线和相应的IC50 值。图3 展示了一个代表性实验中得到的药理学曲线。
多次加样实验中的hERG 离子通道的浓度依赖性抑制(图3)
化合物多次添加方法的数据重复性检测
筛选实验中数据的稳定性是非常重要的。采用前述已优化好的实验条件，所有七次阳性hERG 抑制剂的药理学数据均表现出良好的可重复性。六次化合物添加实验的稳定性展现在图4 中。这种稳定性尤其重要，体现在加样后及施加电压刺激后的稳定电流记录的技术要求方面。
其中一个检测的阳性药物，哌咪清（Pimozide） ，观察到其重复性低于预期。这可能与化合物的高亲脂性相关，从而造成了化合物在筛选过程中多数的塑料材料环境下的不稳定性。
hERG 多次加样实验数据的可重复性 (图 4)
总结
本次实验验证了单孔多次加样方法在保证数据质量的前提下，可以显著增加通量且降低运行成本。
• 通量显著的从 1100增加至4600个数据点每小时。
• 药理学结果方面，单次加样和多次加样的IC50值保持很好一致性。
• 整个实验结果保持稳定性和重现性
• 累积浓度效应数据类似于传统膜片钳技术方法
参考文献
Application protocol: “Validation of the IonWorks Barracuda System for hERG Ion Channel Assay”, by Karen Cook, M.S., James L. Costantin, Ph.D., and Xin Jiang, Ph.D., Molecular Devices, LLC (2011)