最全的空间转录组测序实验总结来了-环球风云-资讯-生物在线

最全的空间转录组测序实验总结来了

作者:上海吉凯基因医学科技股份有限公司 2023-01-13T13:21 (访问量:5824)

随着空间转录组测序成为主要的科研手段,小编下面就总结一些我们实操的实验细节,以及项目经验,以供各位老师参考。

新鲜组织的OCT包埋

一、准备工作:干冰(粉末状),OCT(冰上预冷30min以上)

1. 在包埋模具上做好方向标记,用于确定切片方向;
2.在包埋模具中加入1/3或者更多的OCT;
3. 修剪组织,去除组织表面血液或者组织液
4.将组织放入挤有OCT的包埋模具中,调整好位置
5.往包埋模具中继续加入预冷的OCT,完全覆盖组织
6.将包埋模具置于干冰上,盖上干冰盒盖子,或者微敞开放入-80冰箱速冻
7.待组织块变白后,包埋完成,可以连同包埋模具一同保存运输

 

包埋流程

拍照记录样本信息

二、新鲜组织OCT包埋时注意事项

1.包埋时尽量排空气泡,气泡的产生会在OCT冷却后在组织周围形成空洞,致使切片时容易断裂 ,影响切片效果, 成不了片;

2.对于需要观察特定切面的组织(如血管横截面等),可以在包埋时在组织底部垫衬与包埋盒底部面积等同的A4纸或滤纸,协助维持组织固定切面。必要时可以借助一些快干胶水做底部固定;

3.对于较小的需要同时几个组织包进一个包埋块时(如类器官等组织),也可以在底部垫衬滤纸或者A4纸,使组织尽可能在同一平面上

 
OCT组织送样

· 新鲜组织取下后建议立即包埋,不建议放在组织保护液里寄送,有降解风险;

· 我们会提前给老师寄一些包埋盒和铝箔纸袋,包埋后的组织密封在袋子里,隔绝外部空气和水分,保存会更好;

· 包埋后的组织放在铝箔纸袋里在-80°C放置一天后再干冰寄送,保证组织的凝固效果同时防止RNA降解;

· 若模型样本老师无法自己取材,可以寄送活体小鼠到公司,由动物平台取材,单细胞平台协助进行OCT包埋。需要支付动物取材及尸体处理等费用,同时需要给到取材的protocal,以及在送样前对包埋的具体位置提出明确需求。


石蜡组织送样

· 石蜡样本保守需要切30-40片,按照一张切片5um的厚度,石蜡块包含组织的厚度至少0.2mm;

· 石蜡样本需在切片前确认切片方向,样本放到石蜡切片机上后无法再次调整方向;

· 石蜡样本采用统一的透化条件,不需要透化预实验,但需要进行粘附性预实验,如果有多个石蜡样本,每一个都需要做粘附性预实验。


空转选片

· 样本收到后10个工作日内我们会给到切片、HE染色以及RNA质检结果;

· 若样本质检合格(OCT:RIN≥7;FFPE: DV200>50%),   且HE染色形态相对完整,OCT样本需要老师在给到的TTK格式的图片(使用对应软件打开)中选定6.5*6.5mm2的目标区域进行标记,以便安排透化实验;

· 正式实验需要再次选片,需要提前跟老师约好选片时间;

· 空转不能使用免疫荧光的样本,我们可以给老师做免疫荧光的染色来确定位置,OCT包埋好的组织块,切下来的切片先尝试做免疫荧光,并结合HE染色的结构区域,一起摸索可用的区域在哪里,之后紧接着重新切片做HE染色和透化等空转后续实验;

· 如果老师有免疫荧光或者免疫组化的需求,或者需要切出多余的白片寄回给老师,均需要在售前充分沟通,比如需要的白片厚度、需要观察的目的区域结构等,技术平台也会根据经验给出对应的建议。如果老师给到现成的抗体最佳孵育浓度和时间,我们可以使用老师现有参数,给客观结果,否则还需要摸索免疫荧光的条件。



特殊样本空转注意事项

一、骨组织
  • 骨组织空转一般质检都比较难通过,特别是对于骨龄比较大的样本;
  • 即便质检通过,后面切片也不好切,很容易切碎;
  • 骨组织贴片的时候也比较容易脱片;
  • 对于石蜡骨组织,样本本身可能细胞也比较少,空转捕获到的spot数可能偏少;
  • 骨组织石蜡样本除了容易脱片,且因为不确定透化即RNA释放的效果,不能保证探针对RNA的捕获效率,进而导致最后测到的基因数进一步减少。

二、皮肤组织
  • 皮肤组织切片不好切且透化困难;
  • 皮肤样本因为分层,切片的时候如果纵切,各层暴露的面积太小,如果横切,则很难切除一平层,这个风险需要老师知晓;
  • 如果透化过度,细胞内释放的RNA会弥散,进入附近组织区域,比如说老师这个皮肤组织,可能原本应该是真皮层细胞表达的基因,最后检测分析在皮肤的表皮层的角质层有表达,那就没办法解释;
  • OCT包埋以后本身组织就是一团了,切的时候就算客户标记好方向,但因为皮肤层的特殊性,也很难完全正好一类细胞横切一层;
  • 如果最后透化失败无法继续向下进行实验,老师也要承担前序包括HE染色、切片、RNA质检、透化等费用。

三、血管组织
 

 
  • 人的血管样本通常有疾病模型,杂质较多,质检不容易通过;
  • 血管如果剪开了平切,容易只切到某一种细胞层;
  • (内膜/中膜/外膜),不能包含所有细胞类型;如果纵切;
  • 由于血管壁的中空结构,包埋时容易产生空泡;
  • 小鼠血管较软,相对不容易包埋,对包埋技术要求较高;
  • 基于血管壁的厚度(人动脉直径2.8~3.0cm,厚度约1mm;
  • 小鼠动脉直径0.8mm,厚度约0.06mm),取横截面贴片;
  • 血管中间的部分是空白的,只要周围一圈血管壁才能覆盖芯片;
  • 对空转芯片捕获区域的利用率相对较低。

四、脊髓/骨髓组织
  • 脊髓一般分离出来是半固态,长条状,如果要做空转,OCT包埋时候需要老师将脊髓平铺包埋并标记号方向,这个有一定难度;
  • 我们质检一般切片厚度10um, 脊髓很薄,不好确定脊髓横切面,有找不到老师要的病理区域的风险,可能切不了几刀就切穿了;
  • 骨髓也比较软,不太好包埋,可能组织会变形;
  • 切片的时候,骨髓容易切碎(连带着骨头一起碎掉,破坏骨髓的组织形态)。

五、角膜组织
  • 需要确定横切还是纵切面,空转一个spot 55μm,点与点之间相距100μm,如果连2个点都覆盖不到,那肯定需要横切;
  • 横切的话需要保证在一个平面,如果老师角膜有弧度,包埋需要尽量保证在一个平面;
  • 一般小的组织做空转都需要考虑样本的厚度和面积,老师不确定的可以做预实验。
上海吉凯基因医学科技股份有限公司 商家主页

地 址: 上海市浦东新区张江高科技园区爱迪生路332号

联系人:

电 话: 4006210302

传 真:

Email:service@genechem.com.cn

相关咨询
ADVERTISEMENT